Ánh sáng tia cực tím: Công cụ kiểm soát tốt các bệnh do vi khuẩn trong không khí gây ra

Các bệnh như cảm cúm, lao thường do vi khuẩn tồn tại trong không khí gây ra. Một phương pháp được tiếp cận để ngăn chặn sự lây truyền trong không khí của vi khuẩn, làm bất hoạt mầm bệnh, tăng khả năng kháng khuẩn đó là tia UVC. Phương pháp này đã được biết đến từ lâu nhưng việc ứng dụng rộng rãi còn gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là trong các môi trường công cộng do UV được xác định là một trong những nguyên nhân gây ung thư, đục thủy tinh thể. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần đây lại chứng minh rằng, ánh sáng tia cực tím ngắn (207 đến 222 nm) chỉ có thể làm bất hoạt vi khuẩn mà không hề gây hại cho động vật có vú cũng như con người. Điều này được lý giải bằng việc UVC không thể xuyên qua lớp ngoài của da hoặc mắt người tuy nhiên vi khuẩn lại có kích thước micromet hoặc nhỏ hơn nên chúng rất dễ bị tác động. Ước tính, có hơn 95% virus gây cúm bị bất hoạt bởi ánh sáng cực tím bước sóng ngắn. Với những nghiên cứu mới này, ánh sáng UVC liều thấp, duy trì liên tục ở các địa điểm công cộng hứa hẹn trở thành công cụ lý tưởng để diệt khuẩn, giảm sự lây lan của các bệnh lây truyền trong không khí với mức giá rẻ.
Xem thêm : Đèn UV khử trùng diệt khuẩn không khí

Giới thiệu

Các bệnh do vi khuẩn tồn tại trong không khí gây ra là một trong những thách thức lớn đối với sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới. Các ví dụ phổ biến là cúm, lao có khả năng lây nhiễm ngày càng cao, đặc biệt chúng còn có biến thể kháng thuốc nguy hiểm.

Một cách tác động trực tiếp để ngăn chặn sự lây truyền của bệnh qua trung gian trong không khí là vô hiệu hóa các mầm bệnh. Trên thực tế, hiệu quả kháng khuẩn trong không khí của tia cực tím (UV) đã được chứng minh từ lâu. Ánh sáng tia cực tím có thể làm bất hoạt nhiều loại vi khuẩn kể cả những loại nhạy cảm với thuốc. Tuy nhiên, việc sử dụng rộng rãi ánh sáng cực tím diệt khuẩn trong môi trường công cộng rất hạn chế vì nguồn ánh sáng UV thường được xác định là mối nguy hại cho sức khỏe con người khi chúng gây ung thư, đục thủy tinh thể.

Trong nhiều nghiên cứu gần đây, các nhà khoa học chỉ ra rằng ánh sáng UV bước sóng ngắn được tạo ra bởi đèn excimer với bước sóng từ 207 đến 222nm có khả năng vô hiệu hóa vi khuẩn kháng thuốc, mà không gây hại rõ rệt cho da động vật có vú khi tiếp xúc gần. Lý do là do sự hấp thụ mạnh mẽ trong vật liệu sinh học, ánh sáng UVC không có đủ phạm vi để xuyên qua lớp ngoài (lớp sừng) trên bề mặt da người, cũng như mắt; trong khi đó, vi khuẩn và vi rút thường có kích thước micron hoặc nhỏ hơn nên ánh sáng UVC vẫn có thể tác động và làm bất hoạt chúng.

Các nghiên cứu trước đây về hiệu quả diệt khuẩn của ánh sáng UVC đã được thực hiện trong đó có thí nghiệm về khả năng tiêu diệt cúm A bằng ánh sáng tia cực tím 222nm. Hình 1 mô phỏng thí nghiệm cho thấy các tế bào biểu mô động vật có vú được ủ với các virut trong không khí đã phơi nhiễm ở dạng aerosol hóa với liều UVC là 0, 08 - 1,3 hoặc 2,0 mJ / cm2 ) được tạo ra bởi đèn exciter 222nm. Huỳnh quang màu xanh đã được sử dụng để xác định tổng số tế bào trong một trường nhìn cụ thể, trong khi huỳnh quang màu xanh lá cây cho thấy sự tích hợp của virut cúm A (H1N1) sống vào các tế bào.

Virus cúm A (H1N1) tấn công các tế bào biểu mô của động vật có vú

Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong hình 2 chỉ ra rằng, số lượng virus gây bệnh cúm A đã được loại bỏ đáng kể sau khi chiếu các tia UVC vào trong môi trường.

Với những nghiên cứu khởi đầu về việc ứng dụng ánh sáng tia UV vào trong việc diệt các mầm bệnh lây truyền trong không khí, các nhà khoa học tiếp tục nhiều công trình nghiên cứu khác dựa trên các nguyên tắc sinh học. Kết quả đều chứng minh UVC có khả năng đi qua thành tế bào và làm bất hoạt vi khuẩn, virus có kích thước micromet hoặc nhỏ hơn nhưng do sự hấp thụ mạnh trong vật liệu sinh học mà UVC không thể xuyên qua mắt da và người. Để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm, các nhà khoa học đã tạo ra các giọt aerosol có kích thước tương tự như các giọt nước bọt khi con người ho.

Kết quả thí nghiệm trong hình 2 được lấy ra từ kết quả thí nghiệm khử hoạt tính của virus cúm A (H1N1) bằng ánh sáng tia cực tím 222 nm theo môt hình khử trùng cấp số nhân điển hình, mặt cắt ngang bất hoạt D95  = 1,6 mJ / cm 2 (95% CI: 1.4 -1.9).

Một thí nghiệm khác được tiến hành để so sánh kết quả, nhà khoa học sắp xếp một thí nghiệm tương tự, nhưng sử dụng đèn UVC sản sinh tia cực tím bước sóng 254nm thông thường. Kết quả cho thấy giá trị D95 = 1,1 mJ / cm 2 (95% CI: 1.0 - 1.2) đối với vi-rút H1N1. Như vậy, báo cáo trong các nghiên cứu trước đây về sự bất hoạt của vi khuẩn bằng ánh sáng tia cực tím 222nm và ánh sáng diệt khuẩn phổ rộng 254nm đều có sự tương đồng. Một nghiên cứu khác so sánh sự bất hoạt của virus trên phổ UVC đã cho thấy sự thay đổi về hiệu quả được mong đợi, nhưng hiệu quả bất hoạt tương đối cao, mặc dù nguyên nhân chính xác của việc bất hoạt có thể khác nhau. Tuy nhiên, như đã trình bày ở trên, , ánh sáng UVC dường như không gây độc tế bào đối với các tế bào và mô của con người trong ống nghiệm.

Với các kết quả nghiên cứu này, việc sử dụng ánh sáng UVC ở mức độ thấp tại các địa điểm công cộng có thể là một phương pháp an toàn và hiệu quả để hạn chế lây truyền các bệnh do vi khuẩn trong không khí gây ra. Trên thực tế, việc sử dụng tia cực tím để khử trùng trong không khí không phải là vấn đề mới, chúng được chứng minh từ hơn 80 năm trước.

Việc chiếu xạ tia cực tím trong không khí (UVGI) sử dụng ánh sáng UV bước sóng xa diệt khuẩn thường được thực hiện ở phần trên của căn phòng, với các cửa gió. Điều này dẫn đến việc ngăn chặn hơn 95% bức xạ UV thoát ra khỏi không gian, giúp làm tăng hiệu quả khử trùng một cách đáng kể. Ngược lại, sử dụng đèn UVC ở mức độ thấp, có khả năng an toàn khi tiếp xúc với con người, chúng mang lại lợi ích kháng khuẩn mong muốn mà không cần lo ngại về sức khỏe con người.

Như vậy, ánh sáng UVC là một phương pháp khử trùng mạnh mẽ và rẻ tiền để ngăn ngừa sự nhiễm virus trong không khí mà không gây nguy hiểm cho sức khỏe con người. Điều này góp phần tích cực vào việc triển khai phương án sử dụng các tia UVC ở các địa điểm công cộng để hạn chế lây truyền và lây lan các bệnh do vi khuẩn trong không khí gây ra. Các địa điểm công cộng như bệnh viện, phòng phẫu thuật, trường học, sân bay và không gian máy bay được xem là những nơi cần ứng dụng công nghệ đầu tiên. Cách tiếp cận này có thể giúp hạn chế dịch cúm theo mùa, lây truyền bệnh lao, cũng như các đại dịch lớn trong đó có cả COVID-19

Phương pháp thử nghiệm

Đèn chiếu xa

Một hệ thống chiếu sáng gồm ba đèn excimer chứa hỗn hợp khí Kr-Cl phát ánh sáng ở bước sóng 222nm được thiết lập. Mỗi đèn được phủ một bộ lọc thông dải tùy chỉnh được thiết kế để loại bỏ tất cả trừ bước sóng phát xạ.
Mỗi bộ lọc thông dải (Omega Quang, Brattleboro, VT) có bước sóng trung tâm 222nm và chiều rộng tối đa (FWHM) là 25 nm. Máy quang phổ UV (SPM-002-BT64, Photon Control, BC, Canada) có dải từ 190nm đến 400nm được sử dụng để xác minh phổ phát xạ 222nm.
Một tiêu chuẩn đèn deuterium với bức xạ quang phổ có thể theo dõi NIST (Newport Model 63945, Irvine, CA) đã được sử dụng để hiệu chỉnh bằng phép đo phổ của máy quang phổ UV.
Máy theo dõi Ozone SM-70 (Aeroqual, Avondale, Auckland, New Zealand) đã đo lượng phát sinh ozone từ đèn là

Đo liều UVC

Các phép đo công suất quang được thực hiện bằng cách sử dụng bộ tách sóng silicon tăng cường năng lượng thấp 818-UV / DB với máy đo công suất quang 843-R (Newport, Irvine, CA). Công cụ đo lường được bổ sung để xác định tính đồng nhất của hiện tượng phơi nhiễm UV. Các phép đo được thực hiện giữa các thí nghiệm do cảm biến bên trong thực hiện.

Một loạt các mức phơi nhiễm UVC từ 3,6 J/cm2 đến 281,6 mJ/cm2 được sử dụng để xác định đường hiệu chuẩn đáp ứng. Phim được quét dưới dạng hình ảnh TIFF RGB 48 bit ở 150 dpi bằng máy quét phẳng Epson Perfection V700 Photo (Epson, Nhật Bản) và được phân tích bằng phần mềm phân tích phim phóng xạ 32 để tính tổng phơi sáng dựa trên thay đổi mật độ quang đo được.

Các phép đo sử dụng cả máy dò silicon và màng nhạy cảm với tia cực tím đã được kết hợp để tính tổng liều nhận được khi một hạt đi qua cửa sổ tiếp xúc.
Ba đèn được xếp theo chiều dọc tạo ra sự phân bố liều gần như đồng đều dọc theo trục dọc, do đó mọi hạt đi qua buồng chiếu xạ đều nhận được sự tác động giống hệt nhau.
Chiều rộng của đèn (100 mm) nhỏ hơn chiều rộng của cửa sổ buồng chiếu xạ (260 mm) nên công suất đèn cao hơn ở vị trí gần trung tâm cửa sổ so với cạnh bên. Máy dò silicon được sử dụng để định lượng độ phản xạ của tấm nhôm ở mức xấp xỉ 15% công suất sự cố.
Kết hợp dữ liệu này cho phép tính tổng liều trung bình 2,0 mJ/cm2 cho một tế bào đi qua cửa sổ trong 20 giây. Ngoài ra, máy dò silicon đã được sử dụng để xác nhận độ suy giảm của ánh sáng 222nm thông qua một tấm màng nhựa là 65%. Việc bổ sung một hoặc hai tấm màng nhựa giữa đèn và cửa sổ buồng chiếu xạ mang lại liều trung bình lần lượt là 1,3 mJ/cm2 và 0,8 mJ/cm2.

Buồng chiếu xạ aerosol

Một buồng chiếu xạ aerosol /virus một chiều được xây dựng. Tổng quan về sơ đồ của hệ thống được hiển thị trong Hình 3 và được mô tả trong Hình 4.
Vi rút aerosol được tạo ra bằng cách thêm dung dịch vi rút vào máy xông khí dung (HEART) (Westmed, Tucson, AZ) và vận hành bằng bơm hai đầu (Thermo Fisher 420, 29290000KK, Waltham, MA) với tốc độ dòng chảy đầu vào là 11 L/phút. Virus khí dung đã chảy vào buồng chiếu xạ, nơi nó được kiểm soát độc lập trong môi trường không khí ẩm và khô.
Không khí ẩm được tạo ra bằng cách sủi bọt khí trong nước, trong khi không khí khô được cung cấp bằng cách đưa không khí qua máy sấy không khí hút ẩm. Điều chỉnh tỷ lệ của không khí ẩm và khô cho phép kiểm soát độ ẩm tương đối (RH) trong buồng chiếu xạ, cùng với cài đặt máy phun sương, xác định phân bố kích thước hạt aerosol.

Hình 3: Sơ đồ của buồng chiếu xạ UV tùy chỉnh

Hình 3 mô tả buồng chiếu xạ UV với góc nhìn từ trên xuống. Các bộ phận chính bao gồm:
- Đầu vào không khí ẩm (A)
- Bình hút ẩm cho đầu vào không khí khô (B)
- Máy phun sương (C)
- Vách ngăn (D)
- Máy đo độ ẩm và nhiệt độ (E)
- Máy tạo hạt ( F)
- Đèn UVC xa (G)\
- Bộ lọc thông dải (H)
- Cửa sổ nhựa truyền UVC xa (I)
- Bề mặt nhôm phản chiếu (J)
- BioSampler (K)
Máy bơm được sử dụng để tạo áp lực cho máy phun sương từ đó tạo khí dung và kiểm soát dòng chảy qua hệ thống. Van điều khiển lưu lượng cho phép điều chỉnh thông qua hệ thống. Bộ lọc HEPA được lắp đặt trên tất cả các đầu vào và đầu ra không khí. Các đèn được xếp theo chiều dọc được hướng vào cửa sổ ở bên cạnh buồng để lộ các sol khí đi theo chiều ngang. Đường đi của virus khí dung trong hệ thống trong quá trình lấy mẫu được thể hiện bằng đường chấm màu đỏ.

Hình 4: Hình ảnh của buồng chiếu xạ UV tùy chỉnh

Sau khi kết hợp các đầu vào kiểm soát độ ẩm với virut khí dung, dòng đầu vào được dẫn qua một loạt các vách ngăn thúc đẩy quá trình sấy và trộn giọt để tạo ra sự phân bố hạt đều và độ ẩm ổn định . Độ ẩm và nhiệt độ bên trong buồng chiếu xạ được theo dõi bằng máy đo Omega RH32 (Omega Engineering Inc., Stamford, CT) ngay sau vách ngăn. Một máy sàng hạt Hal Technologies HAL-HPC300 (Fontana, CA) đã được gắn liền với buồng chiếu xạ cho phép lấy mẫu các kích thước hạt trong suốt quá trình hoạt động.

Khi tiếp xúc với tia cực tím, đèn 222nm được đặt cách cửa sổ buồng chiếu xạ 11 cm. Các đèn hướng vào cửa sổ buồng 26 cm × 25,6 cm được xây dựng bằng màng nhựa UV trong suốt dày 254 -m (Topas 8007x10, Topas Advanced Polyme, Florence, KY) và có độ truyền ~ 65% ở 222nm .
Bức tường của phòng chiếu xạ đối diện với cửa sổ trong suốt được xây dựng bằng nhôm đánh bóng để phản xạ một phần ánh sáng UVC trở lại qua vùng phơi sáng, từ đó tăng liều phơi sáng tổng thể bằng cách truyền các photon đi theo cả hai hướng. Độ sâu của buồng chiếu xạ giữa cửa sổ và bảng nhôm là 6,3 cm, tạo ra tổng thể tích phơi sáng là 4.2 L.

Dòng khí dung tiếp tục ra khỏi buồng chiếu xạ đến một bộ van ba chiều để đi qua kênh bypass (được sử dụng khi không cần lấy mẫu) hoặc sử dụng BioSampler (SKC Inc, Eighty Four, PA) để thu thập virus. BioSampler sử dụng phương pháp tạo dòng âm thanh trên bề mặt chất lỏng để thu khí dung khi hoạt động ở lưu lượng không khí 12,5 L/phút.
Cuối cùng, dòng chảy tiếp tục ra khỏi hệ thống thông qua bộ lọc HEPA và đến bơm chân không (WP6111560, EMD Millipore, Billerica, MA). Bơm chân không ở cuối hệ thống cung cấp dòng chảy qua buồng chiếu xạ. Tốc độ dòng chảy qua hệ thống được điều chỉnh bởi BioSampler. Với tốc độ dòng chảy và tổng thể tích phơi sáng của buồng chiếu xạ, 4.2 L, một giọt aerosol duy nhất truyền qua thể tích phơi sáng trong khoảng 20 giây.

Hiệu suất buồng chiếu xạ

Buồng chiếu xạ tùy chỉnh mô phỏng việc truyền vi rut khí dung được tạo ra từ sự ho và thở của con người. Buồng hoạt động ở độ ẩm tương 55% với sự phân bố kích thước hạt là 87% giữa 0,3 µm và 0,5µm, 11% giữa 0,5µm và 0,7 µm, và 2%> 0,7µm.

Giao thức thí nghiệm

Dung dịch virus trong máy phun sương bao gồm 1 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY) chứa 108 đơn vị hình thành tập trung trên mỗi ml (FFU / ml) virus cúm A [A / PR / 8 / 34 (H1N1)], 20 ml nước khử ion và 0,05 ml dung dịch muối cân bằng của Hank với canxi và magiê (HBSS ++ ).
Buồng chiếu xạ được vận hành với các hạt vi rút khí dung chảy qua buồng và kênh bypass trong 15 phút trước khi lấy mẫu, để thiết lập giá trị rh mong muốn ~ 55%.
Quá trình khử trùng được bắt đầu bằng cách thay đổi luồng không khí từ kênh bypass sang BioSampler bằng cách sử dụng bộ van ba chiều. BioSampler ban đầu chứa đầy 20 ml HBSS ++.
Trong mỗi lần lấy mẫu, thời gian kéo dài 30 phút, bên trong buồng chiếu xạ có sự tiếp xúc với ánh sáng tia cực tím 222nm thông qua cửa sổ nhựa bán trong suốt UVC. Sự thay đổi của liều UVC được phân phối cho các hạt aerosol đạt được bằng cách chèn thêm màng nhựa bán trong suốt UVC, giống hệt với vật liệu được sử dụng làm cửa sổ buồng.
Các màng nhựa làm giảm đồng đều năng lượng vào bên trong buồng. Ba liều thử nghiệm là 0.8, 1.3 và 2.0 mJ/cm 2, đã đạt được bằng cách thêm hai, một hoặc không thêm màng nhựa tương ứng.
Các nghiên cứu kiểm soát liều không được thực hiện với đèn excimer đã tắt. Các thí nghiệm ở mỗi liều được lặp lại ba lần.
Một BioSampler mới được sử dụng cho mỗi lần chạy thử nghiệm để ngăn ngừa ô nhiễm không mong muốn. Các biện pháp kiểm soát tiêu cực được áp dụng, trong đó virus bị loại bỏ khỏi hỗn hợp máy phun sương chạy không liên tục cho thấy không có virus nào trong BioSampler.
Sau khi hoàn thành giai đoạn lấy mẫu, mẫu từ BioSampler đã được sử dụng để xét nghiệm lây nhiễm virus.

Xét nghiệm lây nhiễm virus

Các nhà khoa học đã tiến hành đo lường mức độ lây nhiễm của virus bằng một thí nghiệm sử dụng các kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang tiêu chuẩn để phát hiện tế bào chủ bị nhiễm và các hạt virus truyền nhiễm.
Sau 30 phút chạy qua buồng chiếu xạ, 0.5 ml huyền phù virus thu được từ BioSampler phủ lên một lớp tế bào biểu mô Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) nuôi dưỡng thường xuyên trong DMEM được bổ sung 10% Feph Bovine Serum ), 2 mM L-alanyl-L-glutamine, penicillin 100 U / ml và streptomycin 100 μg / ml (Sigma-Aldrich Corp St. Louis, MO, USA).
Các tế bào được ủ với virus trong 45 phút, rửa ba lần bằng HBSS ++ và được ủ qua đêm trong DMEM. Các tế bào bị nhiễm sau đó được cố định trong metanol lạnh 100% ở 4°C trong 5 phút và được tiếp xúc với kháng thể nucleoprotein của virut cúm A [C43] (Abcam ab128193, Cambridge, MA) 1: 200 trong HBSS ++ chứa albumin huyết thanh 1% (BSA; Sigma-Aldrich Corp St. Louis, MO, USA) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút với mức rung nhẹ.
Các tế bào được rửa ba lần trong HBSS ++  và được dán nhãn chống chuột Alexa Fluor-488 (Life Technologies, Grand Island, NY) 1: 800 trong HBSS ++ chứa 1% BSA ở nhiệt độ phòng trong 30 phút với rung nhẹ. 
Sau ba lần làm sạch trong HBSS ++, các tế bào được nhuộm bằng Vectashield chứa DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole) (Phòng thí nghiệm Victor, Burlingame, CA). Hệ thống làm việc được trang bị kính hiển vi huỳnh quang Olympus IX70 máy ảnh kỹ thuật số độ phân giải cao, hiệu quả cao.
Đối với mỗi mẫu, ít nhất ba trường nhìn của hình ảnh DAPI và Alexa-488 được hợp nhất với nhiệm vụ thu thập tin tức.
Phần mềm Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD) sử dụng để phân tích hình ảnh 10 × để đo UV FFU khi tỷ lệ các tế bào bị nhiễm virus chia cho tổng số tế bào.

Phân tích dữ liệu

Phần còn sót lại (S) của virus đã được tính toán bằng cách chia phần của tế bào mang lại sự phát triển vi rút dương tại mỗi lần khử trùng theo công thức: S  = FFU UV / FFU điều khiển.

Các giá trị sống sót được tính toán cho mỗi thử nghiệm lặp lại. Hồi quy tuyến tính được thực hiện bằng cách sử dụng các giá trị ln[S] được chuẩn hóa làm biến phụ thuộc và liều UV (D, mJ/cm2) làm biến độc lập. Trong phương pháp này, sự sống sót của virus ( S) được trang bị cho động học bậc nhất theo phương trình:

 In[ S ] = - k × D 

Trong đó:

-  k là hằng số tốc độ bất hoạt UV hoặc hệ số mẫn cảm (cm2/mJ)

- Độ tin cậy khoảng 95% khi hệ số k được tính bằng phần mềm R3.2.3

- Mặt cắt bất hoạt của virus, D 95 , là liều UV làm bất hoạt 95% virus bị phơi nhiễm, được tính là D 95  = −ln [1 - 0,95] / k.